用于诊断慢性消耗性疾病的MEMS微流控生物传感器设计

长期以来，鹿科动物受到一种神经系统疾病的侵袭，这种疾病对个体来说致死率高达100%，并且具有群体效应。这种疾病被称为慢性消耗性疾病（CWD），是由错误折叠的朊病毒蛋白引起的。该疾病可以通过接触感染者的体液和组织或暴露于受污染的饮用水或食物等环境而传播。目前，慢性消耗性疾病的诊断依赖于酶联免疫吸附测定（ELISA）对鹿淋巴结的筛查和随后的免疫组化（IHC）对ELISA阳性结果的确认。事实证明，这种疾病很难控制，部分原因是目前的检测方案存在敏感性和特异性问题。

据麦姆斯咨询报道，近期，来自美国密苏里-哥伦比亚大学（University of Missouri–Columbia）的研究人员开发了一种准确、快速和低成本的MEMS微流控生物传感装置，用于检测咽后淋巴结（RLNs）中慢性消耗性疾病的病理性朊病毒。相关研究成果以“A microfluidic biosensor for the diagnosis of chronic wasting disease”为题，发表在Microsystems & Nanoengineering期刊上。

图1 用于慢性消耗性疾病诊断的MEMS微流控生物传感器

图2 MEMS微流控生物传感器的操作流程

该MEMS微流控生物传感器的设计包括三种新颖的区域/功能，如图1a所示。

首先，为了有效地聚集朊病毒蛋白，该研究开发了一个专用区域。该区域的特点是两组聚集电极以平行方式连接在单个水平的微流控通道中。每个电极组由电镀金制成的厚斜坡状电极，以及斜坡状通道内由铬（Cr）/金（Au）薄膜制成的45°倾斜的指状电极对组成。这种独特的构造产生了正介电泳（p-DEP）力，从而有效地将朊病毒抗原聚集在通道中心，并被引导流向检测微通道。此外，超过原样品培养基体积90%但不含朊病毒蛋白的大量流体向外通道流动，并被引导到废液排出口。

该微流控生物传感器设计的独特之处在于，利用斜坡状电镀垂直侧壁和倾斜的薄膜指状电极，产生了强大的电场强度和梯度。这种梯度有效地将朊病毒抗原推向了电场强度和梯度最高的通道中心线，无论其在通道的横向或者纵向上的位置如何。与缺乏聚集机制的阻抗型生物传感器相比，通过引入该聚集区域，该生物传感器显著提高了对慢性消耗性疾病朊病毒蛋白的检测灵敏度。

此外，该研究通过使用COMSOL进行大量仿真，确定了最大化通道中心电场强度和梯度的最佳几何形状（图3a）。总而言之，该优化设计通过有效地将朊病毒蛋白聚集在通道中心并将其导向检测区域，从而提高了检测灵敏度。

图3 电场建模与仿真

其次，为了进一步提高慢性消耗性疾病朊病毒蛋白/抗原的浓度，在该MEMS微流控生物传感器中引入了专门的捕获区。该区域由环绕检测电极区域的垂直电极对以及由电镀金制成的垂直指状电极组成。捕获电极利用正介电泳力产生的高电场强度和梯度，足以有效地阻滞和捕获检测电极上表面的朊病毒抗原。这种捕获电极设计确保了朊病毒抗原被捕获，无论其在通道的横向或纵向上的位置如何。

在抗原-抗体结合过程中，捕获电极被激活10分钟，为慢性消耗性疾病朊病毒抗原和固定化抗体之间的相互作用提供了充足的时间。与缺乏这种机制的基于阻抗的生物传感器相比，通过引入这种专用捕获区域，生物传感器的灵敏度大大提高了。这种灵敏度的提高使得其在低浓度下能够可靠地检测慢性消耗性疾病朊病毒蛋白/抗原。此外，该研究利用COMSOL仿真进一步优化了捕获电极的几何形状。

最后，为了最大限度地提高检测灵敏度，研究人员在专用的朊病毒检测区域使用了两组叉指电极（IDE）阵列。其中一组电极阵列是专门为检测目的而设计的，而另一组电极阵列作为阴性对照。该检测区域位于宽度为50 μm的微流控通道内，比聚集区域窄得多。此外，为了获得最佳灵敏度，研究人员使用COMSOL对检测电极的几何形状进行了全面建模和仿真（图3b）。

为进一步评价该MEMS微流控生物传感器的特异性和选择性，研究人员分别对非朊病毒抗原（蓝舌病病毒（BTV）和流行性出血热病毒（EHDV））进行抗朊病毒单抗检测，并对朊病毒抗原进行抗牛冠状病毒（BCV）抗体检测。已知的咽后淋巴结阴性样本和无抗原对照也包括在内。此外，对蛋白酶K酶解后的咽后淋巴结样品进行检测，以确认是否检测到致病性朊病毒。

结果显示，该MEMS微流控生物传感器可以在1:24的稀释度下有效检测到工程朊病毒抗原，而ELISA在1:8的稀释度下能够检测到相同的抗原。该生物传感器对强咽后淋巴结阳性样品的相对检测限（rLOD）为1:1000稀释，而ELISA的相对检测限为1:100。因此，该生物传感器的灵敏度是目前已批准的慢性消耗性疾病诊断方法ELISA的10倍。

总而言之，该研究利用已知的咽后淋巴结阴性样本、一种阴性对照抗体（牛冠状病毒单克隆抗体）和两种阴性对照抗原（蓝舌病病毒和流行性出血热病毒）证实了该微流控生物传感器的特异性和选择性，并且通过检测蛋白酶消化阳性咽后淋巴结样品，验证了该MEMS微流控生物传感器检测致病性朊病毒的能力。

图4 该MEMS微流控生物传感器的特异性、选择性和阴性对照研究

图5 对该MEMS微流控生物传感器检测致病性朊病毒的能力进行验证

审核编辑：刘清